EXTRACCIÓN SIMPLE DE ADN DE ARABIDOPSIS THALIANA

EXTRACCIÓN SIMPLE DE ADN DE ARABIDOPSIS THALIANA

Materiales

• Shorty buffer
• SDS                              1%
• Tris/HCl pH 9.0           0.2 M
• LiCl                              0.4 M
• EDTA                           0.025 M 

Referencia: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2009/2/pdb.rec11660.full?text_only=true

• Isopropanol 
• Agua destilada estéril
• Tubos estériles de 1.5 mL
• Mortero y pistilo estéril
• Puntas estériles
• Micropipetas
• Centrifuga

Procedimiento

1. Cortar 6 plantas completas de Arabidopsis (sin raíz). Colocar en un mortero.
2. Moler el tejido durante el menor tiempo posible.
3. Añadir 500 µL de Shorty buffer.

El Shorty buffer contiene Tris/HCl, LiCl, EDTA y SDS. La función de cada componente es el siguiente: 

-El SDS es un detergente iónico con el que se realiza la lisis, es decir, la ruptura de tejidos celulares con el fin de liberar los ácidos nucleicos. Desnaturaliza las proteínas, por lo tanto ayuda a romper la bicapa lipídica de fosfolípidos de las membranas plasmáticas. Los lípidos de la membrana se descomponen debido a que el detergente deshace las uniones que mantienen la bicapa unida. 

-EDTA es un agente quelante(conocidos como antagonistas o secuestradores de metales pesados) reduce la integridad de la membrana ya que se une a cationes divalentes tales como el calcio y el magnesio. Estos dos iones ayudan a mantener la integridad de la membrana celular.

-Tris/Hcl es una solución estabilizante que mantiene un pH estable en un rango neutro debido a que el proceso de extracción de ADN es sensible a cambios en el pH.

-LiCl (Cloruro de litio) es una sal que precipita el ARN pero no el ADN.  

Referencia: http://genetica.uab.cat/base/documents/genetica_gen/Laura%20Mart%C3%ADnez%20Mart%C3%ADn2015_4_19P21_19.pdf 

4. Continuar moliendo.
5. Añadir 250 µL de Shorty buffer en el pistilo para quitarle el tejido que quedó adherido.
Con el Shorty buffer
6. Transferir la solución a un tubo de 1.5 mL.
7. Centrifugar a 14,000 rpm durante 10 min.
8. Tomar el sobrenadante y transferir a un tubo de 1.5 mL.
9.Añadir 500 µL de isopropanol al tubo.

El ADN después de ser extraído suele ser recuperado mediante isopropanol o etanol. Se utilizan estos dos solventes debido a que son disolventes polares y el ADN es una molécula polar ( el ADN tiene carga electrica negativa dada por los fosfatos en la parte donde se forma el enlace azúcar-fosfato). Se utiliza el isopropanol debido a que el ADN es menos soluble y por lo tanto se precipitará. El inconveniente es que las sales se precipitan al mismo tiempo, pero se obtiene mayor cantidad de precipitado con este disolvente. En el caso de utilizar etanol, se utiliza etanol frío ya que hace que el ADN se vuelve apolar e insoluble permitiendo una mayor concentración de ADN pero aún así se precipitan las sales aunque la temperatura del etanol sea baja.

Precipitación con etanol cuando:

• Disponemos de muestras de pequeño volumen.
• Disponemos de muestras de DNA muy concentradas.
• Necesitamos almacenar la muestra durante un largo periodo de tiempo en frío.

Precipitación con isopropanol cuando:

• Disponemos de mayor volumen de muestra.
• Disponemos de muestras de DNA a baja concentración.
• Queramos acelerar la precipitación a temperatura ambiente.

Referencia: http://www.abyntek.com/precipitacion-de-dna-con-etanol-vs-isopropanol/

Se utiliza de isopropanol de 0.7-1 volumen de la muestra y etanol de 2-2.5 volumenes de la muestra.

Referencia: https://bitesizebio.com/2839/dna-precipitation-ethanol-vs-isopropanol/

10. Centrifugar a velocidad máxima durante 15 minutos. Se da la formación de una pastilla en el fondo del tubo.
11. Colocar encima de una toalla de papel absorbente hasta que se evapore el isopropanol.
Evitar que se caiga la pastilla.
12. Añadir 80 µL de agua destilada estéril.

En este paso se hidrata el ADN para mantenerlo en solución.

Se puede hidratar el ADN con agua pero el pH debe de ser de 7 para permitir la redisolución del ADN y evitar la hidrólisis ácida en la cual se rompen los puentes de hidrógeno que unen a la doble hélice, haciendo que se desnaturalice el ADN. 

13. Colocar el tubo a temperatura ambiente durante 15 minutos con el fin de que la pastilla se resuspenda sin necesidad de resuspender de forma mecánica por pipeteo.
14. Guardar los tubos a 4°C.